PCR eli polymeraasiketjureaktio on pitkälle kehitetty laboratoriotekniikka, jota käytetään laajasti lääketieteessä ja muilla tieteen aloilla. PCR-diagnostiikasta tuli kerralla todellinen läpimurto tieteessä.
Kuvaus
Kvantitatiivinen PCR on eräänlainen reaaliaikainen PCR.
Tämä ymmärretään PCR:n muunnelmaksi, jossa reaktion kinetiikkaa tallennetaan jatkuvasti, mikä mahdollistaa spesifisten DNA-nukleotidisekvenssien sisällön kvalitatiivisen arvioinnin monimutkaisessa molekyyliseoksessa.
Kvantitatiivista PCR-menetelmää käsitellään tarkemmin alla.
Analysoinnin ydin
Kulttuurisia ja serologisia menetelmiä käytetään erityisen usein infektioiden diagnosoinnissa. Ensimmäisessä määritetään tarttuvan patogeenin vasta-aineet veren seerumissa. Toisessa saira alta henkilöltä otettua biologista materiaalia kylvetään spesifinen alusta, joka on suotuisa patogeenipesäkkeiden kasvulle. Diagnostiikka molemmissatapaus voi kestää päiviä tai viikkoja.
PCR-tutkimus voidaan tehdä erilaisilla biologisilla materiaaleilla, jotka saadaan saira alta henkilöltä. Veri ja muut patologiset, fysiologiset ja biologiset väliaineet ja nesteet toimivat näytteinä. Voit tehdä PCR-ulosteen tai virtsan.
Epätyypilliset ja virusinfektiot diagnosoidaan useimmiten kvantitatiivisella PCR:llä, koska niitä ei ehkä ole helppo diagnosoida niiden aiheuttaman patologisen prosessin erityisluonteen vuoksi. Tällaisten infektioiden määrittäminen vie aikaa, jonka aikana elimistössä alkaa muodostua vasta-aineita, jotka määritetään serologisilla menetelmillä. Mutta tätä ei voida hyväksyä joissakin tapauksissa.
Suoritustapa
PCR-menetelmä - infektion havaitseminen laboratoriossa potilaasta eristetyistä näytteistä (in vitro).
Polymeraasiketjureaktion suorittamiseksi tarvitaan joukko erityisiä reagensseja.
Testimateriaali syötetään koeputkiin reagensseilla. Koeputket asetetaan erityiseen laitteeseen - PCR-vahvistimeen, joka on suunniteltu monistamaan (lisäämään) haluttuja RNA- tai DNA-fragmentteja, PCR-vahvistin toimii syklisessä tilassa. Missä tahansa syklissä, jos näytteet sisältävät patogeenin RNA- tai DNA-sekvenssin, liuokseen kerääntyy yhä enemmän kopioita näiden nukleiinihappojen hiukkasista. Voit määrittää taudinaiheuttajan esiintymisen ja sen määrän näytteistä.
PCR-tyypit
PCR-laadullinen analyysi mahdollistaa seuraavan tuloksen:
- negatiivinen, kun kiinnostavaa taudinaiheuttajaa ei löydy näytteistä;
- positiivinen, jos näytteistä löytyy sekvenssejä, jotka ovat ominaisia tietylle taudinaiheuttajalle.
Positiivisen PCR-tuloksen avulla voimme puhua 95 %:n tarkkuudella diagnosoidun infektion olemassaolosta. Samaan aikaan diagnostisiin tarkoituksiin käytettävien PCR-sarjojen tarkkuus saavuttaa 100%.
Yleensä 5 % virheellisistä tuloksista johtuu inhimillisestä tekijästä. Esimerkiksi analyysi- ja reagenssien varastointitekniikan rikkominen voi merkittävästi heikentää tutkimuksen tarkkuutta.
Kvantitatiivinen PCR määrittelee viruskuorman käsitteen. On mahdollista määrittää, kuinka monta patogeeni-DNA-sarjaa oli potilaasta otetuissa näytteissä.
Infektion vakavuus on suoraan verrannollinen niiden määrän lisääntymiseen. Voit myös määrittää hoidon onnistumisen viruskuorman vähentämiseksi.
PCR-biomateriaalin hakemus
Kvantitatiivinen PCR suoritetaan klinikalla, pääasiassa aamuisin. Lääkärikäynnin aikana potilaalle kerrotaan, mitä on otettava: kaavinta, sivelyä, virtsaa tai verta. PCR voi havaita patogeenit materiaalin kontaminaatiotasosta riippumatta.
Positiivisen analyysin saamiseksi näytteissä on teoriassa oltava vain yksi taudinaiheuttaja. Käytännössä he yrittävät luoda vieläkin suotuisammat olosuhteet. Tälle on joitain suosituksia:
- jos he ottavat raavin tai vanupuikolla sukuelimistäelimiä, sinun on pidättäydyttävä läheisestä yhdynnästä kolme päivää ennen tutkimusta;
- et voi suihkuttaa bakteerilääkkeillä tai pestä itseäsi ennen analyysiä;
- kolme tuntia ennen kuin otat näytteen virtsaputkesta, sinun on oltava kärsivällinen etkä tyhjennä suolistoasi.
Älä noudata näitä sääntöjä luovuttaessasi verta.
Miten kvantitatiivisen PCR-analyysin tulokset tulkitaan?
Saatujen tulosten määrällinen arviointi
Useissa kliinisissä tilanteissa ilmenee hoidon tehokkuuden ja/tai patologisen prosessin dynamiikan ongelma. Tällaiset kysymykset ovat erityisen tärkeitä tutkittaessa ihmisiä, joilla on krooninen infektio (ihmisen immuunikatovirus, hepatiitti B ja C). Diagnoosissa ne perustuvat siihen, että amplikonien (PCR-tuotteiden) kerääntyminen on verrannollinen halutun geenin kopioiden esiintymiseen analysoitavassa näytteessä.
Tietenkin kvantitatiivisen PCR:n tulokset otetaan huomioon geelielektroforeesilla, jossa tutkitaan erityisten PCR-signaalien intensiteettiä. Edellytyksenä saatujen tulosten oikealle kvantitatiiviselle arvioinnille ovat myös positiiviset luotettavat kontrollinäytteet, jotka sisältävät tunnetun määrän kopioita halutusta geenistä (esimerkiksi tuhat kopiota hepatiitti C-geenistä yhtä PCR-reaktiota kohden). Useat kvantitatiivisen kontrollin sarjalaimennokset mahdollistavat kalibrointikäyrien luomisen, ja niitä käytetään kliinisten näytteiden kliinisten genokopioiden sisällön arvioimiseen.
Kvantitatiivisen PCR:n määritelmässä keskeinen saavutus on ollut luominenfluoresoivat DNA-koettimet, jotka lisätään reaktioseokseen samanaikaisesti yksinkertaisten alukkeiden kanssa ja joiden avulla voit seurata PCR-prosessia ajoissa, eli reaaliaikaista PCR:ää.
TaqMan-metodologia viittaa fluoresoivien DNA-koettimien synteesiin, jotka ovat spesifisiä amplikonin keskiosalle ja joissa on kaksi leimaa päissä. Yksi niistä on fluoresoiva leima, toinen on tämän fluoresenssin sammuttajamolekyyli.
Erityinen laite, joka on fluorimittarin ja lämpöblokkivahvistimen yhdistelmä, mittaa jatkuvasti fluoresenssia jokaisessa koeputkessa (reaaliaikainen PCR-periaate). 20-40 PCR-syklin jälkeen kullekin näytteelle saadaan yksittäiset käyrät. Testinäytteen sisältämien halutun geenin kopioiden lukumäärä voidaan laskea vertailunäytteiden kalibrointikäyristä.
Tärkeä piirre PCR:n toteutuksessa fluoresoivalla menetelmällä on myös se, että putkia ei tarvitse avata PCR-seoksella, kun otetaan huomioon tulokset. Tämä vähentää amplifikaatiotuotteiden aiheuttamaa huoneen kontaminaatiota, eikä elektroforeesia varten tarvitse varata erityisiä työalueita.
Mitä kvantitatiivinen PCR-transkriptio osoittaa?
Mitä on löydetty?
Kvantitatiivisen PCR:n k altaisen menetelmän avulla geeneissä havaitaan kvalitatiivisia muutoksia: insertioita, deleetioita ja pistemutaatioita. Mutta joidenkin perinnöllisten sairauksien kohdalla vastaavat oireet ilmaantuvat vasteena tiettyjen geenien sisällön muutokseen.
KiitosKvantitatiivinen analyysi antaa numeerisen tuloksen, useimmiten IU / ml. Tämä tarkoittaa, että yhdestä millilitrasta koenäytteestä löydettiin tietty määrä kopioita taudinaiheuttajan RNA:ta tai DNA:ta kansainvälisissä yksiköissä mitattuna.
Riippuen laajuudesta, infektion vakavuus diagnosoidaan. Veri testataan yleensä viruskuorman määrittämiseksi, koska virukset liikkuvat veressä vapaasti sairauden aikana.
Ominaisuudet
Kvantitatiivinen PCR verikokeissa sisältää kaksi ominaisuutta.
- Analyysi suoritetaan, kun läsnä on alukkeita tai deoksiribonukleosiditrifosfaatteja, jotka on leimattu fluoresoivalla tai radioaktiivisella leimalla muodostuneen PCR-tuotteen sisällön määrittämiseksi tarkasti.
- PCR-prosessissa reaktio lopetetaan aikaisin, ennen kuin liian monta PCR-tuotetta ilmestyy. Tämä johtuu siitä, että kyllästymisen loppuvaiheessa, kun PCR-tuotteita on paljon, sekä itse entsyymi että substraatit toimivat tämän reaktion rajoittavina linkkeinä. Seuraavan PCR-syklin loppua tällaisissa olosuhteissa ei enää luonnehdi PCR-tuotteiden määrän kaksinkertaistuminen, vaan merkityksettömät kvantitatiiviset erot eri näytteiden välillä tasoittuvat, jotka ovat varsin selkeästi määriteltyjä alkuvaiheessa reaktiosyklien sarjan läpikäymisen jälkeen..
PCR-diagnostiikan hinta
PCR-tutkimuksella on hintansa, joka riippuu tutkittavasta infektiosta, analyysimetodologiasta ja testimateriaalista. Määrittääksesi yhden infektion, sinun on annettava sisälle200-800 ruplaa. Lisätään myös maksu biomateriaalin ottamisesta - noin 400 ruplaa.
