Kromatografia on yksi menetelmistä aineiden erottamiseksi. Sitä käytetään mikrohiukkasten fysikaalisten ja kemiallisten ominaisuuksien myöhempään kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analysointiin. Tämän tekniikan muunnelma on affiniteettikromatografia. Ajatus proteiiniyhdisteiden erottamisesta molekyyliaffiniteetin ominaisuudella on ollut tieteessä tunnettu useiden vuosikymmenien ajan. Se on kuitenkin saanut kehityksensä vasta viime vuosina, sen jälkeen, kun matriisina käytettyjä erittäin huokoisia hydrofiilisiä materiaaleja on otettu käyttöön. Tällä menetelmällä voidaan ratkaista sekä analyyttisiä ongelmia (aineiden erottelu ja tunnistaminen) että valmisteluongelmia (puhdistus, väkevöinti).
Essence
Affiniteettikromatografia (latinan sanasta affinis - "viereinen", "sukulainen") perustuu affiniteettivuorovaikutuksiin, jotka ovat erittäin spesifisten sidosten muodostumista väliainemolekyylin (ligandin tai affintin) ja kohdemolekyylin välille. Nämä mekanismit ovat luonnossa laajalle levinneitä (välittäjien tai hormonien ja reseptorien, vasta-aineiden jaantigeenit, polynukleotidien hybridisaatio ja muun tyyppiset prosessit). Lääketieteessä affiniteettikromatografiaa on käytetty käytännön tarkoituksiin vuodesta 1951 lähtien
Osat erotetaan seuraavasti:
- eristettävää ainetta sisältävä työliuos johdetaan sorbentin läpi;
- sorbenttimatriisiin kerrostettu ligandi säilyttää tämän aineen;
- se on keskittynyt (kerääntyvä);
- eristetyn aineen uuttaminen sorbentista pesemällä liuottimella.
Tällä menetelmällä voit eristää kokonaisia soluja. Ero perinteiseen sorptiokromatografiaan on se, että eristetyllä komponentilla on vahva biospesifinen sitoutuminen sorbenttiin, jolle on ominaista korkea selektiivisyys.
Adsorbentit
Seuraavia aineita käytetään adsorbentteina:
- Geeliyhdisteet, jotka perustuvat agaroosiin, agarista saatuun polysakkaridiin. Yleisimmin käytettyjä ovat 3 lajiketta: Sepharose 4B, CL (ristisidottu agaroosi) ja affi-gel. Jälkimmäinen koostumus on agaroosin ja polyakryyliamidin modifioitu geeli. Sillä on suurempi biologinen inertti, korkea kemiallinen ja lämmönkestävyys.
- Piihappo (silikageeli).
- Lasi.
- Orgaaniset polymeerit.
Mekaanisten esteiden poistamiseksi ligandikontaktin aikana käytetään lisäaineita erottamaan se kantajasta (peptidit, diamiinit, polyamiinit, oligosakkaridit).
Varusteet
Affiniteettikromatografialaitteisto sisältää seuraavat pääyksiköt:
- varastosäiliötä liikkuvaa vaihetta varten (eluentti);
- korkeapainepumput keskisyöttöön (useimmiten edestakaisin);
- suodatin eluenttien puhdistamiseen pölystä;
- annostelulaite;
- kromatografinen kolonni seoksen erottamista varten;
- ilmaisin sarakkeesta lähtevien erotettujen komponenttien havaitsemiseen;
- kromatogrammitallentimet ja mikroprosessoriyksikkö (tietokone).
Liuenneen ilman määrän vähentämiseksi helium johdetaan ensin liikkuvan faasin läpi. Eluentin pitoisuuden muuttamiseksi asennetaan useita ohjelmoijan ohjaamia pumppuja. Kromatografiakolonnit on valmistettu ruostumattomasta teräksestä (korroosionkestävyyden lisäämiseksi), lasista (yleisvaihtoehto) tai akryylistä. Valmistustarkoituksiin niiden halkaisija voi vaihdella välillä 2 - 70 cm. Analyyttisessä kromatografiassa käytetään mikropylväitä Ø10-150 µm.
Antureiden herkkyyden lisäämiseksi seokseen lisätään reagensseja, jotka edistävät aineiden muodostumista, jotka absorboivat enemmän säteitä spektrin ultravioletti- tai näkyvällä alueella.
Metodologia
Nesteaffiniteettikromatografiaa on 2 päätyyppiä:
- Kolonni, jossa kolonni täytetään stationäärifaasilla ja seos johdetaan sen läpi virtauksellaeluentti. Erottumista voi tapahtua paineen tai painovoiman vaikutuksesta.
- Ohut kerros. Eluentti liikkuu tasaista adsorbenttikerrosta pitkin kapillaarivoimien vaikutuksesta. Adsorbenttia levitetään lasilevylle, keraamiseen tai kvartsitankoon, metallikalvoon.
Työn päävaiheita ovat:
- adsorbentin valmistus, ligandin kiinnitys kantajaan;
- erotusseoksen syöttäminen kromatografiseen kolonniin;
- mobiilifaasilataus, komponenttien sitominen ligandilla;
- vaiheen vaihto sitoutuneen aineen eristämiseksi.
Kohde
Affiniteettikromatografiaa käytetään seuraavan tyyppisten aineiden eristämiseen (käytettävän ligandin tyyppi on merkitty suluissa):
- entsymaattisten estäjien, substraattien ja kofaktorien (entsyymien) analogit;
- bioorgaaniset aineet, joissa on merkkejä geneettisestä vieraaisuudesta, virukset ja solut (vasta-aineet);
- korkean molekyylipainon hiilihydraatit, monosakkaridipolymeerit, glykoproteiinit (lektiinit);
- nukleaariset proteiinit, nukleotidyylitransferaasit (nukleiinihapot);
- reseptorit, kuljetusproteiinit (vitamiinit, hormonit);
- proteiinit vuorovaikutuksessa solukalvojen (solujen) kanssa.
Tätä tekniikkaa käytetään myös immobilisoitujen entsyymien saamiseksi, ja niiden sitominen selluloosaan mahdollistaa immunosorbenttien tuotannon.
DNA:ta sitovien proteiinien kromatografia
DNA:ta sitovien proteiinien eristäminen suoritetaan käyttämällähepariini. Tämä glykosaminoglykaani pystyy sitomaan laajan valikoiman molekyylejä. Tämän ryhmän proteiinien affiniteettikromatografiaa käytetään eristämään aineita, kuten:
- translaation alkamis- ja pidentymistekijät (nukleiinihappomolekyylien ja proteiinien synteesi);
- restriktaasit (entsyymit, jotka tunnistavat tiettyjä sekvenssejä kaksijuosteisessa DNA:ssa);
- DNA-ligaasit ja -polymeraasit (entsyymit, jotka katalysoivat kahden molekyylin yhdistämistä uuden kemiallisen sidoksen muodostamiseksi ja osallistuvat DNA:n replikaatioon);
- seriiniproteaasin estäjät, joilla on tärkeä rooli immuuni- ja tulehdusprosesseissa;
- kasvutekijät: fibroblasti, Schwann, endoteeli;
- sellulaarisen matriisin proteiinit;
- hormonireseptorit;
- lipoproteiinit.
Arvollisuus
Tämä menetelmä on yksi spesifimmistä reaktiivisten yhdisteiden (entsyymien ja suurempien aggregaattien - virusten) eristämiseen. Sitä ei kuitenkaan käytetä vain biologisesti aktiivisten aineiden eristämiseen.
Vasta-aineiden havaitseminen pieninä määrinä, polyadenyylihapon kvantitatiivinen arviointi, dehydrogenaasien molekyylimassojen nopea määritys, tiettyjen epäpuhtauksien poistaminen, trypsiinin inaktiivisen muodon aktivaatiokinetiikan tutkimus, ihmisen molekyylirakenne interferonit - tämä ei ole koko luettelo tutkimuksista, joissa affiniteettia käytetään kromatografia. Käyttö klinikalla johtuu sen eduista, kuten:
- Tehokas puhdistusominaisuusproteiinit, polysakkaridit, nukleiinihapot. Ne eroavat hieman fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksistaan ja menettävät aktiivisuuttaan hydrolyysin, denaturoinnin ja muiden muissa menetelmissä käytettävien käsittelyjen aikana.
- Aineiden erottelun nopeus, prosessin dynaaminen luonne.
- Ei tarvita erityistä entsyymipuhdistusta ja isoentsyymihomogenointia dissosiaatiovakioiden määrittämiseksi.
- Voi erottaa monenlaisia aineita.
- Alhainen ligandien kulutus.
- Mahdollisuus aineiden erottamiseen suurissa määrissä.
- Kääntyvä biologisten makromolekyylien sitoutumisprosessi.
Tätä tekniikkaa voidaan yhdistää muiden kanssa lisäkentän (gravitaatio, sähkömagneettinen) aikaansaamiseksi. Näin voit laajentaa kromatografian teknisiä mahdollisuuksia.
Entsyymitekniikka
Tämän menetelmän ansiosta biotekniikan uuden alan - entsyymitekniikan - aktiivinen kehitys alkoi.
Entsyymieristyksen affiniteettikromatografialla on seuraavat edut:
- entsyymien saaminen suuria määriä lyhyemmän ajan seurauksena, seurauksena - niiden hinnan aleneminen;
- entsyymien immobilisointi voi laajentaa merkittävästi niiden käyttöaluetta lääketieteessä ja teollisuudessa;
- Entsyymien yhdistäminen liukenemattomaan kiinteään kantajaan mahdollistaa mikroympäristön vaikutuksen ja reaktioiden suunnan tutkimisen, joilla on tärkeä rooli luonnollisissa ja fysiologisissa prosesseissa.
