Monien elintarvikkeiden laadullisen koostumuksen määrittämiseen käytetään ksantoproteiinireaktiota proteiinin suhteen. Aromaattisten aminohappojen läsnäolo yhdisteessä antaa positiivisen värimuutoksen testinäytteelle.
Mikä on proteiini
Sitä kutsutaan myös proteiiniksi, joka on elävän organismin rakennusmateriaali. Proteiinit ylläpitävät lihasten volyymia, palauttavat eri elinten vaurioituneita ja kuolleita kudosrakenteita, olipa kyseessä sitten hiukset, iho tai nivelsiteet. Heidän osallistumisensa avulla tuotetaan punasoluja, monien hormonien ja immuunijärjestelmän solujen normaalia toimintaa säädellään.
Tämä on monimutkainen molekyyli, joka on polypeptidi, jonka massa on suurempi kuin 6103 d altonia. Proteiinirakenteen muodostavat suuria määriä aminohappotähteet, jotka on yhdistetty peptidisidoksella.
Proteiinin rakenne
Näiden aineiden erottuva piirre pienimolekyylipainoisiin peptideihin verrattuna on niiden kehittynyt spatiaalinen kolmiulotteinen rakenne, jota tukevat eri vaikutteetvetovoiman aste. Proteiineilla on nelitasoinen rakenne. Jokaisella niistä on omat ominaisuutensa.
Heidän molekyylien ensisijainen järjestys perustuu aminohapposekvenssiin, jonka rakenteen tunnistaa ksantoproteiinin reaktio proteiiniin. Tällainen rakenne on ajoittain toistuva peptidisidos -HN-CH-CO-, ja aminokarboksyylihappojen sivuketjuradikaalit ovat selektiivinen osa. He määrittävät aineen ominaisuudet kokonaisuutena tulevaisuudessa.
Primääriproteiinin rakennetta pidetään riittävän vahvana, tämä johtuu vahvoista kovalenttisista vuorovaikutuksista peptidisidoksissa. Seuraavien tasojen muodostuminen tapahtuu alkuvaiheessa havaituista merkeistä riippuen.
Sekundaarisen rakenteen muodostuminen on mahdollista johtuen aminohapposekvenssin kiertymisestä spiraaliksi, jossa käänteiden väliin muodostuu vetysidoksia.
Molekyylin tertiäärinen organisoitumistaso muodostuu, kun yksi kierteen osa asettuu muiden fragmenttien päälle ja niiden välille muodostuu kaikenlaisia sidoksia vety-, disulfidi-, kovalenttisella tai ionisella yhdisteellä. Tuloksena on assosiaatioita pallojen muodossa.
Tertiääristen rakenteiden avaruudellinen järjestely ja niiden välisten kemiallisten sidosten muodostuminen johtaa molekyylin lopullisen muodon tai kvaternaarisen tason muodostumiseen.
Aminohapot
Ne määrittävät proteiinien kemialliset ominaisuudet. Pääaminohappoja on noin 20,sisältyy polypeptidien koostumukseen eri sekvensseissä. Tämä sisältää myös harvinaiset aminokarboksyylihapot hydroksiproliinin ja hydroksilysiinin muodossa, jotka ovat emäksisten peptidien johdannaisia.
Ksantoproteiinien proteiinitunnistuksen reaktion merkkinä yksittäisten aminohappojen läsnäolo muuttaa reagenssien väriä, mikä viittaa tiettyjen rakenteiden esiintymiseen niiden koostumuksessa.
Kuten kävi ilmi, ne ovat kaikki karboksyylihappoja, joissa vetyatomi on korvattu aminoryhmällä.
Esimerkki molekyylin rakenteesta on glysiinin (HNH−HCH−COOH) rakennekaava yksinkertaisimpana aminohappona.
Tässä tapauksessa yksi vetyistä CH2- hiili voidaan korvata pidemmällä radikaalilla, mukaan lukien bentseenirengas, amino-, sulfo-, karboksiryhmät.
Mitä ksantoproteiinireaktio tarkoittaa
Kvalitatiiviseen proteiinianalyysiin käytetään erilaisia menetelmiä. Näitä ovat reaktiot:
- biureetti violetilla värillä;
- ninhydriini muodostaa sinivioletin liuoksen;
- formaldehydi punaisella tahralla;
- Foil, jossa on harmaa-musta sedimentaatio.
Kunkin menetelmää suoritettaessa todistetaan proteiinien ja tietyn funktionaalisen ryhmän läsnäolo niiden molekyylissä.
Ksantoproteiini reagoi proteiiniin. Sitä kutsutaan myös Mulderin testiksi. Se viittaa proteiinien värireaktioihinjotka ovat aromaattisia ja heterosyklisiä aminohappoja.
Tällaisen testin ominaisuus on syklisten aminohappotähteiden nitrausprosessi typpihapolla, erityisesti nitroryhmän lisääminen bentseenirenkaaseen.
Tämän prosessin tuloksena muodostuu nitroyhdistettä, joka saostuu. Tämä on tärkein merkki ksantoproteiinireaktiosta.
Mitkä aminohapot määritetään
Kaikkia aminokarboksyylihappoja ei voida havaita tällä testillä. Proteiinin tunnistamisen ksantoproteiinireaktion pääpiirre on bentseenirenkaan tai heterosyklin läsnäolo aminohappomolekyylissä.
Proteiiniaminokarboksyylihapoista eristetään kaksi aromaattista happoa, joissa on fenyyliryhmä (fenyylialaniinissa) ja hydroksifenyyliradikaali (tyrosiinissa).
Ksantoproteiinireaktiota käytetään määrittämään heterosyklinen aminohappo tryptofaani, jossa on aromaattinen indoliydin. Yllä olevien yhdisteiden läsnäolo proteiinissa antaa testiväliaineelle ominaisen värinmuutoksen.
Mitä reagensseja käytetään
Ksantoproteiinireaktion suorittamiseksi sinun on valmistettava 1-prosenttinen muna- tai kasviproteiiniliuos.
Käytä yleensä kananmunaa, joka rikotaan proteiinin erottamiseksi keltuaisesta. Liuoksen saamiseksi 1 % proteiinia laimennetaan kymmenkertaiseen määrään puhdistettua vettä. Proteiinin liuottamisen jälkeen tuloksena oleva neste on suodatettava useiden sideharsokerrosten läpi. Tämä liuos tulee säilyttää viileässä paikassa.
Voit suorittaa reaktion kasviproteiinilla. Liuoksen valmistukseen käytetään vehnäjauhoja 0,04 kg. Lisää 0,16 l puhdistettua vettä. Ainesosat sekoitetaan pullossa, joka asetetaan 24 tunniksi kylmään paikkaan, jonka lämpötila on noin + 1 ° C. Päivän kuluttua liuosta ravistetaan, minkä jälkeen se suodatetaan ensin puuvillavillalla ja sitten paperilaskostetulla suodattimella. Saatu neste säilytetään kylmässä paikassa. Tällaisessa liuoksessa on pääasiassa albumiinifraktiota.
Ksantoproteiinireaktion suorittamiseksi pääreagenssina käytetään väkevää typpihappoa. Muita reagensseja ovat 10 % natriumhydroksidin tai ammoniakin liuos, gelatiiniliuos ja väkevöimätön fenoli.
Metodologia
Lisää puhtaaseen koeputkeen 1 % munaproteiiniliuosta tai jauhoja 2 ml:n määränä. Siihen lisätään noin 9 tippaa väkevää typpihappoa hiutaleiden putoamisen estämiseksi. Saatua seosta kuumennetaan, minkä seurauksena sakka muuttuu keltaiseksi ja häviää vähitellen, ja sen väri liukenee.
Kun neste jäähtyy, noin 9 tippaa väkevää natriumhydroksidia lisätään koeputkeen seinää pitkin, mikä on prosessin ylimäärä. Väliaineen reaktio muuttuu emäksiseksi. Putken sisältö muuttuu oranssiksi.
Ominaisuudet
Koska ksantoproteiinia kutsutaan kvalitatiiviseksi reaktioksi proteiineihintyppihapon vaikutuksesta, testi suoritetaan mukana toimitetun vetokuvun alla. Noudata kaikkia turvatoimenpiteitä työskennellessäsi väkevien syövyttävien aineiden kanssa.
Lämmitysprosessin aikana putken sisältö voi tulla ulos, mikä tulee ottaa huomioon kiinnitettäessä se pidikkeeseen ja valittaessa k altevuutta.
Typpihapon ja natriumhydroksidin ottaminen tulee tehdä vain lasipipetillä ja kumipallolla, suulla kirjoittaminen on kielletty.
Vertaileva reaktio fenolin kanssa
Prosessin havainnollistamiseksi ja fenyyliryhmän läsnäolon varmistamiseksi suoritetaan samanlainen testi hydroksibentseenillä.
Laita koeputkeen 2 ml laimennettua fenolia ja lisää sitten vähitellen seinämää pitkin 2 ml väkevää typpihappoa. Liuos kuumennetaan, minkä seurauksena se muuttuu keltaiseksi. Tämä reaktio on kvalitatiivinen bentseenirenkaan läsnäolon suhteen.
Hydroksibentseenin nitrausprosessiin typpihapolla liittyy paranitrofenolin ja ortonitrofenolin seoksen muodostuminen prosenttisuhteessa 15:35.
Gelatiinin vertailu
Todistamaan, että ksantoproteiinireaktio proteiiniin havaitsee vain aminohappoja, joilla on aromaattinen rakenne, käytetään proteiineja, joissa ei ole fenoliryhmää.
Työtä 1 % gelatiiniliuosta 2 ml puhtaaseen koeputkeen. Siihen lisätään noin 9 tippaa väkevää typpihappoa. Tuloksena oleva seos kuumennetaan. Liuos ei kellastu, mikä todistaa sen puuttumisenaminohappoja, joilla on aromaattinen rakenne. Väliaineen lievää kellastumista havaitaan joskus proteiiniepäpuhtauksien vuoksi.
Kemialliset yhtälöt
Ksantoproteiinireaktio proteiineihin tapahtuu kahdessa vaiheessa. Ensimmäisen vaiheen kaava kuvaa aminohappomolekyylin nitrausprosessia käyttämällä väkevää typpihappoa.
Esimerkki on nitroryhmän lisääminen tyrosiiniin nitrotyrosiinin ja dinitrotyrosiinin muodostamiseksi. Ensimmäisessä tapauksessa yksi NO2-radikaali on kiinnittynyt bentseenirenkaaseen, ja toisessa tapauksessa kaksi vetyatomia korvataan NO2. Ksantoproteiinireaktion kemiallista kaavaa edustaa tyrosiinin vuorovaikutus typpihapon kanssa nitrotyrosiinimolekyylin muodostamiseksi.
Nitrausprosessiin liittyy värittömän värin siirtyminen keltaiseen sävyyn. Kun samanlainen reaktio suoritetaan proteiineille, jotka sisältävät tryptofaanin tai fenyylialaniinin aminohappotähteitä, myös liuoksen väri muuttuu.
Toisessa vaiheessa tyrosiinimolekyylin nitraustuotteet, erityisesti nitrotyrosiini, ovat vuorovaikutuksessa ammonium- tai natriumhydroksidin kanssa. Tuloksena on natrium- tai ammoniumsuola, joka on väriltään keltaoranssia. Tämä reaktio liittyy nitrotyrosiinimolekyylin kykyyn siirtyä kinoidimuotoon. Myöhemmin siitä muodostuu nitronihapon suola, jossa on kaksoiskonjugoitujen sidosten kinonijärjestelmä.
Näin ksantoproteiinien reaktio proteiineihin päättyy. Yhtälö kaksivaihe on esitetty yllä.
Tulokset
Kolmeen koeputkeen sisältyvien nesteiden analyysissä laimea fenoli toimii vertailuliuoksena. Aineet, joissa on bentseenirengas, antavat kvalitatiivisen reaktion typpihapon kanssa. Tämän seurauksena liuoksen väri muuttuu.
Kuten tiedät, gelatiini sisältää kollageenia hydrolysoidussa muodossa. Tämä proteiini ei sisällä aromaattisia aminokarboksyylihappoja. Vuorovaikutuksessa hapon kanssa väliaineen väri ei muutu.
Kolmannessa koeputkessa havaitaan positiivinen ksantoproteiinireaktio proteiineihin. Johtopäätös voidaan tehdä seuraavasti: kaikki aromaattisen rakenteen omaavat proteiinit, oli se sitten fenyyliryhmä tai indolirengas, antavat liuokselle värinmuutoksen. Tämä johtuu keltaisten nitroyhdisteiden muodostumisesta.
Värireaktion suorittaminen osoittaa, että aminohapoissa ja proteiineissa on erilaisia kemiallisia rakenteita. Gelatiiniesimerkki osoittaa, että se sisältää aminokarboksyylihappoja, joissa ei ole fenyyliryhmää tai syklistä rakennetta.
Ksantoproteiinireaktio voi selittää ihon kellastumisen, kun siihen levitetään vahvaa typpihappoa. Maitovaahto saa saman värin, kun sillä tehdään tällainen analyysi.
Lääketieteellisessä laboratoriossa tätä värinäytettä ei käytetä proteiinin havaitsemiseen virtsasta. Tämä johtuu itse virtsan keltaisesta väristä.
Ksantoproteiinireaktiota on käytetty yhä enemmän aminohappojen, kuten tryptofaanin ja tyrosiinin, kvantifiointiin eri proteiineissa.
