Yhdistelmä-DNA ovat molekyylejä, jotka on muodostettu laboratoriogeneettisillä rekombinaatiotekniikoilla yhdistämään geneettistä materiaalia useista lähteistä. Se on mahdollista, koska kaikkien organismien DNA-molekyylillä on sama kemiallinen rakenne ja ne eroavat vain niiden sisällä olevasta nukleotidisekvenssistä.
Luominen
Molekylaarinen kloonaus on laboratorioprosessi, jota käytetään yhdistelmä-DNA:n luomiseen. Se on yksi kahdesta laajimmin käytetystä menetelmästä yhdessä polymeraasiketjureaktion (PCR) kanssa. Sen avulla voit ohjata minkä tahansa kokeilijan valitseman DNA-sekvenssin replikaatiota.
Yhdistelmä-DNA-menetelmien välillä on kaksi perustavanlaatuista eroa. Yksi on se, että molekyylikloonaukseen liittyy replikaatio elävässä solussa, kun taas PCR liittyy in vitro. Toinen ero on se, että ensimmäinen menetelmä mahdollistaa DNA-sekvenssien leikkaamisen ja liittämisen, kun taas toista menetelmää tehostetaan kopioimalla olemassa oleva järjestys.
Vektori-DNA
Yhdistelmä-DNA:n saaminen vaatii kloonausvektorin. Se on peräisin plasmideista tai viruksista ja on suhteellisen pieni segmentti. Vektorin valinta molekyylikloonausta varten riippuu isäntäorganismin valinnasta, kloonattavan DNA:n koosta ja siitä, onko vieraita molekyylejä ilmennettävä. Segmenttejä voidaan yhdistää käyttämällä erilaisia menetelmiä, kuten restriktioentsyymi/ligaasikloonausta tai Gibson-kokoonpanoa.
Kloonaus
Vakioprotokollassa kloonaus sisältää seitsemän vaihetta.
- Valitse isäntäorganismi ja kloonausvektori.
- DNA-vektorin saaminen.
- Kloonatun DNA:n muodostuminen.
- Yhdistelmä-DNA:n luominen.
- Sen vieminen isäntäorganismiin.
- Valikko sitä sisältävistä organismeista.
- Kloonien valinta halutuilla DNA-inserteillä ja biologisilla ominaisuuksilla.
Isäntäorganismiin siirron jälkeen rekombinanttikonstruktin sisältämät vieraat molekyylit voivat ilmentyä tai olla ilmentämättä. Ekspressio vaatii geenin uudelleenjärjestelyä sisältämään sekvenssejä, jotka ovat välttämättömiä DNA:n tuottamiseksi. Isännän käännöskone käyttää sitä.
Kuinka se toimii
Yhdistelmä-DNA toimii, kun isäntäsolu ilmentää yhdistelmä-DNA-geenistä peräisin olevaa proteiinia. Ilmentyminen riippuu geenin ympäröimisestä joukolla signaaleja, jotka antavat ohjeita sen transkriptioon. Niihin kuuluvat promoottori, ribosomin sitoutuminen ja terminaattori.
Ongelmia syntyy, jos geenisisältää introneja tai signaaleja, jotka toimivat bakteeri-isännän terminaattoreina. Tämä johtaa ennenaikaiseen lopettamiseen. Rekombinanttiproteiini voi olla väärin prosessoitu, laskostunut tai hajotettu. Sen tuotanto eukaryoottisissa järjestelmissä tapahtuu yleensä hiivoissa ja rihmasienissä. Eläinhäkkien käyttö on vaikeaa, koska monille tarvitaan vahva tukipinta.
Eliöiden ominaisuudet
Rekombinantti-DNA-molekyylejä sisältävillä organismeilla on ilmeisen normaalit fenotyypit. Niiden ulkonäkö, käyttäytyminen ja aineenvaihdunta eivät yleensä muutu. Ainoa tapa osoittaa rekombinanttisekvenssien läsnäolo on tutkia itse DNA polymeraasiketjureaktiotestillä.
Joissakin tapauksissa yhdistelmä-DNA:lla voi olla haitallisia vaikutuksia. Tämä voi tapahtua, kun sen aktiivisen promoottorin sisältävä fragmentti sijaitsee aiemmin hiljaisen isäntäsolugeenin vieressä.
Käytä
Yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käytetään laajasti biotekniikassa, lääketieteessä ja tutkimuksessa. Sen proteiineja ja muita tuotteita löytyy melkein jokaisesta länsimaisesta apteekista, eläinlääkäriasemasta, lääkärin vastaanotosta, lääketieteellisestä tai biologisesta laboratoriosta.
Yleisin sovellus on perustutkimuksessa, jossa teknologia on olennainen osa tämän päivän työtä biologian ja biolääketieteen alalla. Yhdistelmä-DNA:ta käytetään geenien tunnistamiseen, kartoittamiseen ja sekvensointiin sekä niiden määrittämiseentoimintoja. rDNA-koettimia käytetään analysoimaan geeniekspressiota yksittäisissä soluissa ja kokonaisten organismien kudoksissa. Rekombinanttiproteiineja käytetään reagensseina laboratoriokokeissa. Alla on joitain konkreettisia esimerkkejä.
Rekombinantti kymosiini
Kymosiini on juuston valmistukseen tarvittava entsyymi, joka löytyy abomasumista. Se oli ensimmäinen teollisuudessa käytetty geneettisesti muunneltu elintarvikelisäaine. Mikrobiologisesti valmistettu rekombinanttientsyymi, joka on rakenteeltaan identtinen vasikasta peräisin olevan entsyymin kanssa, on halvempi ja sitä tuotetaan suurempia määriä.
Rekombinantti ihmisinsuliini
Korvattiin käytännössä eläinperäisestä (esim. sioista ja nautakarjasta) peräisin oleva insuliini insuliinista riippuvaisen diabeteksen hoidossa. Rekombinantti-insuliini syntetisoidaan viemällä ihmisinsuliinigeeni Eterichia- tai hiiva-suvun bakteereihin.
Kasvuhormoni
Määrätty potilaille, joiden aivolisäke ei tuota tarpeeksi kasvuhormonia tukemaan normaalia kehitystä. Ennen kuin rekombinanttikasvuhormonia tuli saataville, sitä saatiin ruumiiden aivolisäkkeestä. Tämä vaarallinen käytäntö on johtanut joihinkin potilaisiin Creutzfeldt-Jakobin taudin kehittymiseen.
Rekombinantti hyytymistekijä
Tämä on veren hyytymistä edistävä proteiini, jota annetaan potilaille, joilla on hemofilian muotoja ja verenvuotohäiriöitä. He eivät pysty tuottamaantekijä VIII riittävinä määrinä. Ennen rekombinanttitekijä VIII:n kehittämistä proteiini valmistettiin käsittelemällä suuria määriä ihmisverta useilta luovuttajilta. Tähän liittyi erittäin suuri tartuntatautien leviämisriski.
HIV-infektion diagnoosi
Jokainen kolmesta yleisesti käytetystä HIV-infektion diagnosointimenetelmästä on kehitetty käyttämällä yhdistelmä-DNA:ta. Vasta-ainetesti käyttää hänen proteiiniaan. Se havaitsee HIV:n geneettisen materiaalin läsnäolon käänteistranskription polymeraasiketjureaktion avulla. Testin kehittäminen mahdollisti HIV-genomien molekyylikloonauksen ja sekvensoinnin.
