Virtaussytometria on sytologinen tutkimusmenetelmä, jota käytetään solujen syvälliseen analysointiin. Sen etuna on, että sen avulla voit tutkia jokaista solua erikseen. Tämäntyyppinen analyysi auttaa arvioimaan useita parametreja sadoissa soluissa muutamassa sekunnissa. Tämän seurauksena sytofluorimetriaa pidetään yhtenä nopeimmista ja tarkimmista tutkijoiden ja kliinikkojen tällä hetkellä saatavilla olevista analyysimenetelmistä.
Periaate
Virtaussytometrian periaate perustuu solujen valonsironta- ja luminesenssin (fluoresenssin) mittaamiseen. Solususpensio johdetaan suurella nopeudella virtana sytometrikennon läpi, jossa se säteilytetään laserilla. Siellä tehdään myös ns. hydrodynaaminen tarkennus. Sen mekanismi on, että kennosta tuleva virtaus tutkittujen hiukkasten kanssa ulostulossa virtaa ulkoiseen suihkuun, jolla on suurempi nopeus. Tämän seurauksena hiukkaset ovat linjassa järjestetyssä ketjussa.
Esisolut on leimattu erityisillä fluoresoivilla väriaineilla (fluorokromeilla). Kiitos heille, lasersädeherättää toissijaisen hehkun. Vastaanotetut valosignaalit rekisteröivät tunnistimet. Myöhemmin tiedot käsitellään ohjelmistoalgoritmeilla, joiden avulla voit laskea yksittäisiä solupopulaatioita, jotka eroavat joissakin kriteereissä.
Perinteisellä mikroskopialla tehdyssä tutkimuksessa ei useinkaan pystytä erottamaan eri soluja, koska ne näyttävät sam alta. Sytofluorimetria voi tuottaa muita tietoja (DNA-rakenteen eheys), analysoida proteiinien ilmentymistä, solujen eloonjäämistä.
Koska fluorokromien viritys vaatii valonsäteitä eri aallonpituuksilla sekä erityyppisiä ilmaisimia, nykyaikaiset laitteistot on varustettu useilla ilmaisukanavilla (4-30). Lasersäteilijöiden lukumäärä voi olla 1-7. Monimutkaisemmat laitteet mahdollistavat useiden hiukkasten ominaisuuksien moniparametriset tutkimukset kerralla.
Edut ja haitat
Virtussytometrian etuja ovat:
- korkea käsittelynopeus (jopa 30 000 tapahtuman rekisteröinti sekunnissa);
- mahdollisuus tutkia suurta määrää soluja (jopa 100 miljoonaa näytteessä);
- Fluoresoivan valon voimakkuuden määrittäminen;
- kunkin solun analyysi;
- heterogeenisten prosessien samanaikainen tutkimus;
- tietojen automaattinen erottelu solupopulaatioiden mukaan;
- tulosten laadukas visualisointi.
Toinen tämän tekniikan ominaisuus on seanalysoitu partikkeli voidaan värjätä useilla fluoresoivilla liuoksilla. Tämän ansiosta tapahtuu moniparametrinen tutkimus.
Haittoja ovat teknisen laitteiston monimutkaisuus ja erikoisnäytteen valmistelun tarve.
Sytometrit
Ensimmäiset tämän tyyppiset laitteet ilmestyivät Saksassa jo vuonna 1968, mutta ne yleistyivät paljon myöhemmin. Tällä hetkellä kaikki virtaussytometriamenetelmällä toimivat laitteet voidaan jakaa kahteen tyyppiin:
- laitteet, jotka mittaavat fluoresoivaa säteilyä (kaksi tai useampia aallonpituuksia), 10° ja 90° valonsironta (pienikulmainen ja sivusironnan ilmaisin);
- laitteet, jotka useiden solukkoparametrien mittaamisen lisäksi lajittelevat automaattisesti ryhmiin näiden kriteerien mukaan.
Eteensirontatunnistin on suunniteltu määrittämään solun koko, ja sivusirontalaitteen avulla voit saada tietoa solunsisäisten rakeiden läsnäolosta, sytoplasman ja ytimen tilavuussuhteesta.
Klassiset sytometrit, toisin kuin valomikroskoopit, eivät salli kuvan saamista solusta. Viime vuosina on kuitenkin kehitetty yhdistettyjä laitteita, jotka pystyvät yhdistämään mikroskoopin ja sytofluorimetrin ominaisuudet. Niitä käsitellään alla.
Kuvaussytometrit
Klassisessa virtaussytometriassa käytettävät instrumentit,yksi piirre on tyypillinen: jos harvinaisia tapahtumia rekisteröidään analysoitujen solujen populaatiossa, ei ole mitään keinoa arvioida niiden olemusta. Nämä hiukkaset voivat olla joko kuolleiden solujen jäänteitä tai harvinainen ryhmä niitä. Perinteisissä laitteissa tällaiset tiedot jätetään pois yleisestä tapahtumavirrasta, mutta juuri ne voivat olla erityisen arvokkaita tieteellisessä ja kliinisessä analyysissä.
Uuden sukupolven kuvantavien virtaussytometrien avulla voit kaapata kuvan jokaisesta solusta, joka kulkee virtauksessa ilmaisinalueen läpi. Se on helppo nähdä napsauttamalla vastaavaa kaavion aluetta, joka näkyy tietokoneen näytössä.
Sovellusalueet
Virtaussytometria on universaali menetelmä, jota käytetään monilla lääketieteen ja tieteen aloilla:
- immunologia;
- onkologia;
- transplantologia (punaisen luuytimen, kantasolujen siirto);
- hematologia;
- toksikologia;
- biokemia (happamuuden mittaus solun sisällä, muiden parametrien tutkimus);
- farmakologia (uusien lääkkeiden luominen);
- mikrobiologia;
- parasitologia ja virologia;
- oceanology (kasviplanktonin tutkimus vesistöjen tilan arvioimiseksi ja muihin tehtäviin);
- nanoteknologia ja mikrohiukkasanalyysi.
Immunologia
Ihmisen immuunijärjestelmä koostuu monenlaisista soluista. Virtaussytometria immunologiassa mahdollistaa niiden rakenteen ja toimintojen arvioinnin, eli morfofunktionaalisten tutkimusten suorittamisen.analyysi.
Tällainen tutkimus auttaa ymmärtämään immuniteetin monimutkaisen luonteen. Solujen fenotyypit muuttuvat antigeenien aktivoitumisen, patologioiden kehittymisen ja muiden tekijöiden seurauksena. Sytofluorometria voi erottaa immuunisolujen alapopulaatiot monimutkaisessa seoksessa ja arvioida kaikki niiden muutokset ajan myötä.
Onkologia
Yksi onkologian tärkeimmistä tehtävistä on solujen erilaistuminen niiden tyypin mukaan. Onkohematologian virtaussytometrisen analyysin periaate perustuu seuraavaan ilmiöön: kun näytettä käsitellään erityisellä fluoresoivalla väriaineella, se sitoutuu sytoplasman proteiineihin. Aktiivisesti lisääntyvien solujen jakautumisen jälkeen sen pitoisuus vähenee puoleen. Vastaavasti solun luminesenssin intensiteetti laskee kaksinkertaiseksi.
On olemassa muita tapoja havaita lisääntyvät solut:
- DNA:ta sitovien väriaineiden käyttö (propidiumjodidi);
- merkityn urasiilin käyttö;
- solusyklin säätelyyn osallistuvien sykliiniproteiinien lisääntyneen ilmentymisen rekisteröinti.
